引言
昆蟲可以綜合多種感官線索在環(huán)境中進(jìn)行導(dǎo)航，以找到合適的食物來源、交配伙伴或產(chǎn)卵地點(diǎn)。要了解昆蟲在多變的嗅覺環(huán)境中的飛行行為，需要一個(gè)三維空間詳細(xì)分析其飛行行為。本研究將介紹在三維環(huán)境中跟蹤Anopheles gambiae sensu lato蚊子的飛行，分析在嚴(yán)格控制的氣候條件下蚊子對(duì)人類釋放的體味和二氧化碳的宿主尋找行為。
根據(jù)過往研究和觀察，雌性嗜人血蚊子對(duì)人類宿主氣味的遠(yuǎn)程飛行策略是，蚊子在接觸到帶有氣味的空氣后會(huì)向上風(fēng)方向飛行，如果蹤跡消失，則會(huì)進(jìn)行橫風(fēng)飛行。在中等距離，蚊子受到人類釋放二氧化碳和體味的影響，會(huì)使用高對(duì)比度的視覺特征，并在存在短距離宿主線索（如體溫和濕度）的情況下開始著陸。雖然這些基本特征是所有尋找宿主的蚊子物種所共有的，但在各自感官線索的相對(duì)重要性，可能因宿主偏好和日常飛行活動(dòng)模式等有所不同。
材料與方法
風(fēng)洞系統(tǒng)
研究所使用的風(fēng)洞系統(tǒng)如圖1所示。從氣候室到預(yù)備室和飛行區(qū)域，空氣要經(jīng)過一個(gè)均衡器，其中氣流的溫度、濕度和速度變化都會(huì)得到穩(wěn)定（圖1A）。在預(yù)備室內(nèi)，可以通過引入氣味源等方法操縱流向飛行區(qū)域的氣流。
在上述風(fēng)洞裝置中跟蹤蚊子的飛行行為。風(fēng)洞溫度調(diào)整為 27.0°C，相對(duì)濕度為 70%，風(fēng)速設(shè)定為 0.22 m s-1。
氣味刺激
氣味刺激由放置在風(fēng)洞系統(tǒng)預(yù)備室中的兩個(gè)不同裝置（玻璃環(huán)和金屬襪子架）提供（圖2A、B）。不同濃度的二氧化碳通過一個(gè)等距開孔的玻璃環(huán)產(chǎn)生氣流。人類體味則采用實(shí)驗(yàn)者穿過的襪子：在實(shí)驗(yàn)前19-21小時(shí)穿上黑色棉襪，將其卷起，然后懸掛在金屬鉤上。穿過的襪子可提供最多1小時(shí)的氣味源，之后用洗滌劑清洗后再重復(fù)使用。
研究一中的氣味刺激是空氣或1,200 ppm二氧化碳與人腳氣味或相應(yīng)對(duì)照組（即無襪子和干凈襪子）的組合。由此產(chǎn)生的處理組合為 “空氣/空氣”、“二氧化碳/空氣”、“空氣/干凈的襪子”、“空氣/使用過的襪子”和“二氧化碳/使用過的襪子”。在研究二中，二氧化碳本身的濃度為環(huán)境濃度（400 ppm 至 445 ppm）或高濃度（1,200、2,400、4,800 ppm）。
實(shí)驗(yàn)程序
本研究使用的蚊子為Anopheles gambiae sensu lato蚊子。在每次試驗(yàn)中，裝有一只雌蚊的釋放籠被放置在釋放點(diǎn)。蚊子經(jīng)過2分鐘的適應(yīng)期后，開始錄像，并打開釋放籠的門。在3分鐘內(nèi)未進(jìn)入拍攝的飛行區(qū)域（圖2A，灰色區(qū)域）的蚊子將被剔除，不再做進(jìn)一步分析。記錄有反應(yīng)的蚊子飛行行為，直到它們?cè)谏巷L(fēng)屏上著陸至少5秒，或連續(xù)飛行長達(dá)10分鐘。每次試驗(yàn)后，目測(cè)蚊子的反應(yīng)（“飛行”、“不飛行”）和著陸地點(diǎn)（“上風(fēng)屏”、“其他”、“未著陸”）。每只蚊子只測(cè)試一次。
視頻追蹤和飛行軌跡重建
使用諾達(dá)思的多視頻錄制軟件(Media Recorder)以60幀/秒的速度從風(fēng)洞上方用兩臺(tái)紅外光敏感GigE攝像機(jī)（圖2A）記錄飛行行為。六個(gè)紅外陣列提供照明，放置在飛行區(qū)域的下風(fēng)端。在風(fēng)洞的上風(fēng)端，有一個(gè)LED 陣列，提供低強(qiáng)度的漫射可見白光，用于蚊子的視覺定向。相機(jī)以一定角度安裝在風(fēng)洞上方。
諾達(dá)思的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)用于將兩臺(tái)攝像機(jī)的視頻文件轉(zhuǎn)換為二維位置數(shù)據(jù)。使用諾達(dá)思的三維運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(Track3D)將二維位置數(shù)據(jù)合并為三維飛行軌跡。以下變量由Track3D計(jì)算并用于后續(xù)分析：三維位置（x、y、z）、飛行速度和垂直面航向角。
研究結(jié)果
研究一——人類宿主
在447只接受測(cè)試的蚊子中，有161只在打開籠門后3分鐘內(nèi)做出反應(yīng)，進(jìn)入拍攝區(qū)域。人類宿主對(duì)蚊子的反應(yīng)數(shù)量有顯著影響，其中二氧化碳和人類腳味這兩個(gè)因素以及它們之間的相互作用對(duì)觀察到的影響有顯著作用。與所有其他處理相比，同時(shí)暴露于二氧化碳和人腳味時(shí)，有更大比例的蚊子（約70%）進(jìn)入拍攝區(qū)域（圖3A）。其他處理之間沒有明顯差異。
當(dāng)存在人類宿主線索時(shí)，蚊子在研究設(shè)定的感興趣體積（VOI）內(nèi)飛行的比例較大（圖3B）。二氧化碳和人腳氣味的組合誘發(fā)蚊子在VOI內(nèi)飛行的比例較高。與空氣對(duì)照組相比，單獨(dú)的人腳氣味會(huì)導(dǎo)致在VOI內(nèi)的飛行顯著增加，而空氣對(duì)照組與清潔襪子對(duì)照組之間沒有差異。
在分析至少接觸過一次VOI的蚊子的平均橫風(fēng)飛行速度時(shí)（圖3C），發(fā)現(xiàn)人腳氣味和空氣對(duì)照的組合與清潔襪子控制之間存在顯著差異。與空氣對(duì)照組相比，接觸二氧化碳和人腳氣味的蚊子平均飛行速度快1.3倍。
在161只蚊子中，有108只在10分鐘的最長記錄時(shí)間內(nèi)著陸。不同處理之間沒有明顯差異（圖3D）。然而，蚊子落在目標(biāo)區(qū)域的比例受到二氧化碳和人腳氣味因素的顯著影響，在二氧化碳和人腳氣味的作用下，57%的蚊子落在上風(fēng)屏上的目標(biāo)區(qū)域，而空氣和清潔襪子對(duì)照分別為3%和10%。這些差異在不同處理間有顯著性差異（圖3D、E）。
研究二——二氧化碳
在研究二中，235只蚊子有107只進(jìn)入了拍攝區(qū)域。未觀察到二氧化碳濃度的顯著影響。未觀察到二氧化碳濃度對(duì)VOI內(nèi)飛行比例的影響。VOI內(nèi)的飛行比例普遍較低，從1200 ppm的0.2%到2400 ppm的2.9%不等。在比較兩種處理方法時(shí)，沒有觀察到橫風(fēng)飛行速度的顯著差異。兩種處理之間沒有橫風(fēng)飛行頻率增加的趨勢(shì)。在10分鐘的最長記錄時(shí)間內(nèi)，101只蚊子中有77只落下。沒有觀察到蚊子降落的總比例有顯著差異，也沒有觀察到落在目標(biāo)區(qū)域的蚊子比例。
討論
本文的研究展示了在風(fēng)洞系統(tǒng)中運(yùn)用三維軌跡分析蚊子飛行的實(shí)驗(yàn)研究。在本研究中，當(dāng)人類腳味和二氧化碳結(jié)合在一起時(shí)，蚊子的橫風(fēng)飛行速度更快，在氣味流中停留的時(shí)間更長，并更成功地鎖定氣味源。相比之下，雌性Anopheles gambiae sensu lato蚊子在不同濃度的二氧化碳作用下，并沒有表現(xiàn)出尋找宿主的行為。這些觀察結(jié)果支持了之前關(guān)于人類宿主相關(guān)線索在宿主尋找中過程中作用的研究結(jié)果，并證實(shí)了二氧化碳不是單獨(dú)的宿主尋找線索。本文為未來不同環(huán)境下研究昆蟲三維空間飛行行為提供了方法。
參考文獻(xiàn)
Hinze, Annika, et al. “Mosquito host seeking in 3D using a versatile climate-controlled wind tunnel system.” Frontiers in Behavioral Neuroscience 15 (2021): 643693.
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